Дырка в плакате, которая объяснила один упрямый резак
Под брезентовым шатром на площади я пытаюсь вырубить ровное окошко в толстом плакате. Пресс вроде простой, но не кусает бумагу, пока я не защёлкну внутрь две тонкие полоски: полоску с рисунком и жёсткую подкладку. Без подкладки шаблон болтается, а пресс только мнёт.
Этот капризный пресс хорошо похож на Cas9: это белок, которым бактерии пользуются как охранником с ножницами. Все знали, что рядом крутятся РНК и ДНК, но была беда с управлением. С одной маленькой РНК Cas9 часто не мог нормально ухватить нужную двойную ДНК и разрезать.
Поворот случился, когда поняли простую вещь: Cas9 нужен не один «шаблон», а пара РНК. crRNA как полоска с напечатанным узором, а tracrRNA как жёсткая подкладка, которая держит форму. Когда они сцеплены, Cas9 режет по совпадению, но только при магнии, как пресс, который работает, когда шарнир не сухой. Вывод: рабочий шаблон это две РНК вместе.
И даже с парой РНК Cas9 не начинает резать где попало. Сначала он ищет рядом короткую метку PAM, как маленькую регистрационную отметку у края будущего окна. Нет PAM и захват не держится. Нашёл PAM и требует почти идеального совпадения в начале участка рядом с меткой; дальше мелкие промахи иногда проходят.
Когда Cas9 уже «вцепился», он ломает ДНК сразу в двух нитях. Внутри одного инструмента работают две режущие части, как челюсть с двумя лезвиями: одно режет нить, которая совпала с узором, другое режет противоположную. Разрез получается на предсказуемом расстоянии от PAM, будто пресс всегда кусает чуть в стороне от отметки, иногда оставляя край неровным.
Потом инструмент сделали удобнее: две РНК можно слить в одну длинную направляющую, как если бы шаблон и подкладку заламинировали в одну деталь для пресса. Не любая такая деталь работает: важны изгибы и «ручки», за которые Cas9 держится. И разные Cas9 из разных бактерий любят свои формы направляющей, как прессы под разные вставки.
Под шатром я снова защёлкиваю обе полоски и пресс наконец вырубает чистое окно там, где надо. Так же и с Cas9: нужна правильно сложенная направляющая, рядом должна быть метка PAM, и внутри есть два «лезвия» для обеих нитей ДНК. Когда эти правила стали ясны, этот бактериальный трюк стало можно настраивать под выбранные места, а не надеяться на удачу.